Análisis de variabilidad de secuencia in vivo de RNAs circulares con ribozimas

Abstract

Recientemente se han descubierto retrotransposones LTR no autónomos que se expresan como RNAs circulares con ribozimas HHR, bautizados como retrozimas. En este estudio se ha realizado un análisis detallado de la variabilidad natural de un retrozima de Fragaria ananassa bajo diversas condiciones. Concretamente se estudió el grado de variabilidad in vivo en el retrozima elegido, la cantidad de variantes de secuencia que aparecen en el tiempo, si el hecho de que el RNA del retrozima circularice o no afecta a la variabilidad del retrozima, y qué efectos tiene la variabilidad observada en su estructura secundaria. Para ello se diseñaron distintas construcciones utilizadas para la transformacióngenética de dos modelos de plantas, para posteriormente purificar y extraer el RNA y realizar una secuenciación mediante Sanger. Las secuencias obtenidas fueron ordenadas y utilizadas para realizar un análisis de variantes mediante scripts inhouse en que se utilizan Biopython, bwa-mem, BCFtools y SAMtools, mientras que las estructuras secundarias se obtuvieron mediante el servicio web RNAalifold. En los experimentos realizados se confirmó la aparición de un mismo grupo de variantes estables que indicarían algún tipo de ventaja adaptativa o edición específica de los circRNAs que las contienen. Además, se ha demostrado que la variabilidad en retrozimas mutados que dan lugar a RNA lineales es mínima comparada con la observada en los retrozimas con circRNAs. La posible función específica de estas variantes estables queda aún por determinar en futuros experimentos, ya que ni siquiera parecieron influir en motivos conservados ni en las estructuras secundarias obtenidas.

Non-autonomous LTR retrotransposons that are expressed as circular RNAs with HHR ribozymes, named as retrozymes, have recently been discovered. In this study we carried out a detailed analysis of the natural variability of a Fragaria ananassa retrozyme under different conditions. Specifically, we studied the degree of in vivo variability in the chosen retrozyme, the number of variants that appear over time, whether the circularization of the RNA of the retrozyme affects or not the variability of the retrozyme, and the effect of the variability in its secondary structure. Different constructs were designed for the genetic transformation of two plant models to purify and extract the RNA and perform Sanger sequencing. The sequences obtained were ordered and used to perform an analysis of variants using inhouse scripts with Biopython, bwa-mem, BCFtools and SAMtools, while the secondary structures were obtained using the RNAalifold web service. The experiments carried out confirmed the presence of the same group of stable variants, which would indicate some type of adaptive advantage or specific edition of the circRNAs. Furthermore, it has been shown that the variability in mutated retrozymes that encode linear RNAs is minimal compared to the variability of circRNAs. The specific function of these stable variants remains to be determined in future experiments, since it does not seem to influence in conserved motifs or its secondary structure.

Recentment s'han descobert retrotransposons LTR no autònoms que s'expressen com RNAs circulars amb enzima d'àcid ribonuclèic HHR, batejats amb retrozyme. En aquest estudi s'ha realitzat una anàlisi detallada de la variabilitat natural d'un retrozima de Fragaria ananassa sota diverses condicions. Concretament es va estudiar el grau de variabilitat in vivo en el retrozima elegit, la quantitat de variants de seqüència que apareixen en el temps, si el fet que el RNA del retrozyme circularice o no afecta la variabilitat del retrozyme, i quins efectes té la variabilitat observada en la seva estructura secundària. Per a això es van dissenyar diferents construccions utilitzades per a la transformació genètica de dos models de plantes, per posteriorment purificar i extreure el RNA i realitzar una seqüenciació mitjançant Sanger. Les seqüències obtingudes van ser ordenades i utilitzades per realitzar un anàlisi de variants mitjançant scripts Inhouse en què s'utilitzen Biopython, bwa-mem, BCFtools i SAMtools, mentre que les estructures secundàries es van obtenir mitjançant el servei web RNAalifold. En els experiments realitzats es va confirmar l'aparició d'un mateix grup de variants estables que indicarien algun tipus d'avantatge adaptativa o edició específica dels circRNAs que les contenen. A més, s'ha demostrat que la variabilitat en els retrozyme mutats que donen lloc a RNA lineals és mínima comparada amb l'observada en els retrozyme amb circRNAs. La possible funció específica d'aquestes variants estables queda encara per determinar en futurs experiments, ja que ni tan sols van semblar influir en motius conservats ni en les estructures secundàries obtingudes.